Microscopio De Contraste De Fases: Qué Es, Inventor, Partes, Desventajas
El contraste de fase es un método de microscopía que acelera la trayectoria directa de la luz para causar patrones de interferencia destructivos en la imagen vista. Los microscopios de contraste de fase son útiles para ver detalles en bacterias, protozoos, células sanguíneas, colas de espermatozoides y una variedad de células no teñidas. La tinción puede matar especímenes vivos, por lo que esto es especialmente importante cuando se trata de muestras vivas. Los microscopios de contraste de fase se utilizan para ver muestras que tienen el mismo color que su fondo.
El contraste de fase se puede agregar a algunos microscopios biológicos de campo claro agregando un control deslizante de fase simple (solo si hay una ranura en el condensador para un control deslizante de contraste de fase) y un objetivo de microscopio de contraste de fase. Una configuración de microscopio de contraste de fase completa incluye un condensador de contraste de fase, objetivos de contraste de fase y un telescopio de centrado de fase. Obtenga más información sobre el contraste de fase aquí.
Microscopio de contraste de fases para que sirve
El microscopio de contraste de fase es una versión modificada del microscopio de campo claro que ayuda a visualizar las células vivas sin afectar la viabilidad de las células. Se denomina contraste de fase porque consta de un condensador de contraste de fase único (anillo anular) y un objetivo de contraste de fase (placa de fase). Estas piezas amplifican la diferencia de fase de las muestras transparentes.
Quién inventó el microscopio de contraste de fases
El físico holandés Frits Zernike gano pmio nobel por su invención del microscopio de contraste de fase. Frits Zernike en 1930 se dedicó a la óptica y resolvió el problema de la influencia de las aberraciones de la lente en el patrón de difracción en un foco junto con sus alumnos. En un congreso médico y físico en Wageningen en 1933, Zernike explicó por primera vez su técnica de contraste de fase en microscopía. Desafortunadamente para Zernike, su descubrimiento del fenómeno de contraste de fase no recibió gran atención de inmediato. Se cree que las fábricas de Zeiss en Jena subestimaron el valor de su invento y pasó casi otra década hasta que la Wehrmacht alemana hizo un inventario de todos los inventos que podrían servir en la guerra que finalmente se fabricaron los primeros microscopios de contraste de fase.
Principio del microscopio de contraste de fase
Consideremos la luz como una onda. Dos haces idénticos de lanzamientos de luz en sincronización desde una fuente. El primer haz de luz incide en un material con un índice de refracción más alto que el aire. El haz de luz se ralentiza y el número de ondas de luz aumenta en proporción al índice de refracción y al grosor del material. Pero el segundo rayo viaja solo por el aire. Aunque los rayos de luz estaban sincronizados, se establece una diferencia en la fase de los haces después de viajar a través de diferentes medios. Se denomina diferencia de fase.
Cada espécimen puede difractar el haz de luz. Se forma una imagen debido a la diferencia de fase entre los haces difractados y no difractados (luz directa). Un objeto manchado o coloreado tiene suficiente diferencia de fase para crear una imagen.
Dado que la diferencia de fase entre la luz difractada y la directa es insuficiente en muestras transparentes. Un disco (anillo anular) en el condensador separa la luz directa y la difractada. Asimismo, una placa especial (placa de fase) en la parte posterior del plano focal de la lente del objetivo aumenta la diferencia de fase entre la luz difractada y la luz directa. El aumento resultante en la diferencia de fase ayuda a formar la imagen de objetos transparentes sin mancharse.
Un físico, Frits Zernike, dio este principio en 1932 y usó este principio en microscopía en 1935. Fue galardonado con el Premio Nobel de física por este trabajo.
Partes del microscopio de contraste de fase
El microscopio de contraste de fase tiene todas las partes del microscopio y algunas partes adicionales. Ellos son:
Anillo anular
Un anillo anular o anillo de fase es un anillo claro en un disco opaco. El propósito del aparato es producir un círculo de luz en el plano focal frontal del condensador. Por lo tanto, el condensador se enfoca en la placa de muestra. El anillo anular es diferente para diferentes objetivos.
Placa de fase
Una placa de fase es una placa transparente con un anillo circular en ella. El anillo de la placa de fase está lleno de material de avance y retardo de fase. El anillo de la placa puede parecer más claro o más oscuro que otras partes de la placa. Hay una adición de algún material que cambia la amplitud de la luz. La posición de la placa de fase es complementaria a la del anillo anular. Sin embargo, la posición del anillo de fase está sobre la imagen del anillo anular. Entonces, la placa de fase es parte de la lente del objetivo y tiene partes conjugadas y complementarias.
Telescopio de fase
Un telescopio de fase es un ocular especial que enfoca la imagen focal posterior de un objetivo en una retina humana. Este procedimiento es necesario para alinear el anillo anular con la placa de fase. La lente Bertrand reemplaza el telescopio de fase en algunos microscopios.
Montaje del aparato del microscopio de contraste de fase
El correcto funcionamiento del microscopio de fase requiere un montaje y una alineación adecuados del aparato de fase. Siga los pasos a continuación para ensamblar el aparato de fase:
Se prefiere la iluminación de Kohler para este tipo de microscopía porque el contraste de fase requiere que el condensador produzca ondas de luz casi paralelas en la muestra.
Después de configurar el microscopio con iluminación Kohler, abra completamente el iris del condensador.
Luego, enfoque la muestra con un objetivo de baja potencia con placa de fase. E inserte el anillo anular del tamaño adecuado.
Después de eso, reemplace un ocular con un telescopio de fase. Y enfoque el telescopio en el anillo anular.
Alinee la placa de fase con el anillo anular.
Finalmente, observe la placa de fase y el anillo anular a través del telescopio.
Mecanismo de trabajo del Microscopio de Contraste de Fase
En la microscopía de contraste de fase, la iluminación de la muestra ocurre cuando la luz pasa a través de un anillo anular. Produce un cono hueco de luz.
En este microscopio, un conjunto de rayos de luz proviene directamente de la fuente de luz (luz directa). Por el contrario, el otro conjunto proviene de la luz reflejada o difractada por una estructura particular en la muestra.
Los rayos de luz directos golpean un anillo de fase en la placa de fase dentro del objetivo para dar un fondo brillante. Al mismo tiempo, los rayos difractados pierden el anillo y atraviesan el resto de la placa para proporcionar estructuras oscuras y bien definidas.
Cuando los dos conjuntos de rayos de luz, directos y difractados, se juntan, forman una imagen del espécimen en la lente ocular con un fondo brillante y diferentes áreas oscuras. Este tipo de microscopía se llama microscopía de contraste de fase oscura.
Tipos de contraste de fase
Dependiendo de la construcción de las placas de fase, existen varios tipos de microscopía de contraste de fase. Los tipos más comunes son
Contraste de fase positivo
El contraste de fase positivo hace avanzar la luz directa en ¼ de onda, produciendo interferencia destructiva y detalles oscuros en un fondo claro. Es la forma más utilizada.
Contraste de fase negativo
El contraste de fase negativo retarda la luz directa en ¼ de onda, produciendo interferencia constructiva y detalles de luz sobre un fondo oscuro.
Contraste de fase positivo o negativo
La placa de fase en esta forma es de dos tipos. La placa de fase absorbe la luz directa o puede absorber la luz difractada.
Aplicación del microscopio de contraste de fase
Un microscopio de contraste de fase se aplica en varias investigaciones biológicas para visualizar muestras transparentes como células vivas en cultivo, pedazos de tejido, microorganismos, fibras, partículas subcelulares, fragmentos de vidrio y dispersiones de látex.
Desventajas del microscopio de contraste de fase
Hay alguna limitación en el microscopio de contraste de fase. Estos son:
Funciona excelente para observar especímenes delgados, incoloros y transparentes. Sin embargo, se verá una imagen de fase confusa si la muestra es gruesa.
El montaje de las piezas del microscopio encarece todo el procedimiento.
La placa de fase limita la NA (apertura numérica) del objetivo.