Qué es un microscopio de fluorescencia y para qué sirve
Un microscopio de fluorescencia se utiliza para estudiar muestras orgánicas e inorgánicas. La microscopía de fluorescencia utiliza la fluorescencia y la fosforescencia para examinar la organización estructural y la distribución espacial de las muestras. Se utiliza especialmente para estudiar muestras que son complejas y no se pueden examinar con un microscopio convencional de luz transmitida. Las imágenes de microscopía de fluorescencia ayudan a estudiar sustancias presentes en bajas concentraciones donde la alta sensibilidad es crucial para detectarlas.
Qué es un microscopio de fluorescencia y para qué sirve
En pocas palabras, un microscopio de fluorescencia es cualquier microscopio que utiliza la fluorescencia para estudiar muestras en lugar de utilizar los métodos de iluminación y aumento regulares que se encuentran en la mayoría de los microscopios ópticos tradicionales. Los microscopios de fluorescencia son útiles cuando los científicos necesitan estudiar muestras complejas que no se pueden estudiar a fondo con un microscopio normal. También se pueden usar con muestras presentes en concentraciones tan bajas que se necesita un microscopio de alta sensibilidad para detectarlas.
Microscopio de fluorescencia inventor
En la década de 1670, el científico holandés Antonie Von Leeuwenhoek descubrió por primera vez formas de vida microbiana a través de su simple microscopio de luz, un hallazgo que iniciaría una revolución en el campo de la microscopía. Desde sus primeras observaciones de lo que él denominó ‘animacules’, el campo ha visto un salto cuántico desde sus microscopios de lente única de diseño propio hasta los actuales microscopios crioelectrónicos de alta resolución. Entre estos avances tecnológicos estuvo el advenimiento de la microscopía de fluorescencia, un campo que sigue siendo fundamental para la investigación biológica moderna. En este artículo exploraremos los principios básicos que rigen los microscopios de fluorescencia, los componentes involucrados y sus diferentes variantes.
Partes de un microscopio de fluorescencia
Una fuente de luz poderosa (lámpara de arco de mercurio o xenón):
La luz emitida por la lámpara de arco de mercurio es de 10 a 100 veces más brillante que la mayoría de las lámparas incandescentes y proporciona luz en una amplia gama de longitudes de onda, desde ultravioleta hasta infrarrojo.
Filtro de excitación:
el propósito del filtro de excitación es filtrar todas las longitudes de onda de la fuente de luz, excepto el rango de excitación del fluoróforo bajo inspección. El brillo y la brillantez de las imágenes están dictados por el porcentaje mínimo de transmisión del filtro. La transmisión ideal es >85%.
El espejo dicroico (divisor de haz):
El espejo dicroico o divisor de haz se coloca en un ángulo de 45° entre el filtro de excitación y el filtro de emisión. La función de un filtro dicroico es reflejar la señal de excitación hacia el fluoróforo y transmitir la señal de emisión hacia el detector.
Filtro de emisión:
El filtro de emisión está ubicado dentro de la trayectoria de imágenes de un microscopio de fluorescencia. Su trabajo es filtrar todo el rango de excitación y transmitir el rango de emisión del fluoróforo bajo inspección.
Lente objetivo:
El propósito del lente objetivo es transmitir luz a la muestra para formar la imagen. La luz pasa a través del espejo dicroico antes de llegar a la lente del objetivo.
Sistema de cámara:
Un sistema de cámara ayuda a grabar las imágenes del espécimen con alta resolución. Las cámaras CCD (Charge Coupled Device) se utilizan a menudo en el sistema. Estas cámaras multiplicadoras de electrones son buenas para obtener imágenes de eventos de un solo fotón sin pérdida de sensibilidad. No requieren un intensificador de imágenes y las imágenes se pueden capturar a alta velocidad.
¿Cómo funciona un microscopio de fluorescencia ?
En muchos sentidos, la construcción de un microscopio de fluorescencia es similar a su equivalente de luz tradicional. Hay dos características distintas que distinguen a los microscopios de fluorescencia: (1) los microscopios de fluorescencia utilizan una fuente de luz muy potente y (2) utilizan filtros especializados, como el filtro de excitación y el filtro de emisión. Las fuentes de luz más comunes que usan los microscopios de fluorescencia incluyen lámparas de arco de xenón y lámparas de vapor de mercurio, aunque algunas también usan fuentes supercontinuas, LED o láser. Una lámpara de vapor de mercurio tiende a arder entre 10 y 100 veces más brillante que las lámparas utilizadas en los microscopios tradicionales, y puede emitir longitudes de onda que van desde el infrarrojo hasta el ultravioleta. Mientras tanto, los filtros de excitación y emisión controlan las longitudes de onda del microscopio’
Un fluoróforo es una molécula fluorescente que absorbe luz a una longitud de onda determinada y luego la vuelve a emitir cuando el fluoróforo se «»excita».» En la mayoría de los entornos de laboratorio, el fluoróforo se agrega químicamente (o biológicamente) a la muestra que se está estudiando para identificar proteínas, anticuerpos o aminoácidos, según el tipo de fluoróforo utilizado. Después de agregar el fluoróforo, los filtros del microscopio de fluorescencia separarán la radiación circundante de la luz fluorescente de la muestra para que la luz fluorescente sea todo lo que vea el usuario.
Además de tener una poderosa fuente de luz, un filtro de excitación y un filtro de emisión, un microscopio de fluorescencia también usa un espejo dicroico, una lente objetivo y un sistema de cámara. El espejo dicroico funciona como un divisor de haz, lo que significa que literalmente divide el haz de luz de la fuente de luz en dos, colocados en un ángulo de 45 grados entre el filtro de excitación y el filtro de emisión. La lente del objetivo simplemente transmite luz desde la fuente de luz a la muestra después de que pasa por primera vez a través del espejo dicroico, produciendo una imagen observable. El sistema de cámara del microscopio permite al usuario capturar imágenes de alta resolución y alta velocidad de la muestra, lo que es especialmente útil en el aula y en entornos de investigación, donde se espera un mayor estudio y observación de la muestra.
Los microscopios de fluorescencia pueden ser tan simples como un microscopio de epifluorescencia o tan complejos como un microscopio confocal. Un tipo no es necesariamente mejor que otro, y el tipo que cualquier persona necesita dependerá de la configuración y las aplicaciones para las que se utilizarán los microscopios. Los seis tipos principales de microscopios de fluorescencia incluyen epifluorescencia, LED, vertical, invertido, confocal y de campo amplio. Los microscopios de epifluorescencia, que son los más comunes, casi siempre se usan en aplicaciones de ciencias de la vida para estudiar la estructura de las células orgánicas, mientras que los microscopios confocales más complicados se usan a menudo en entornos industriales para inspeccionar cosas como los semiconductores.
¿Para qué se utilizan los microscopios de fluorescencia?
Debido a que los microscopios de fluorescencia son únicos en la forma en que pueden ayudar a los científicos a identificar células y componentes celulares, son más beneficiosos en aplicaciones de biología y ciencia de materiales. Algunos entornos específicos en los que se utilizan microscopios de fluorescencia incluyen:
Histoquímica:
Este es un campo de la ciencia que combina la bioquímica y la histología para estudiar los componentes químicos de las células y los tejidos. Por ejemplo, los microscopios de fluorescencia pueden detectar aminas biogénicas que sirven como neurotransmisores, como la dopamina, la serotonina, la norepinefrina y la epinefrina, que son demasiado pequeñas para detectarlas con un microscopio óptico tradicional.
Química de los alimentos:
Este campo específico de la química evalúa la organización estructural y los procesos químicos de los componentes de los alimentos. Conocer y comprender la microestructura de cualquier alimento afecta sus cualidades nutricionales y físicas, por lo que los químicos alimentarios desempeñan un papel importante en el control de calidad y en la seguridad de los consumidores.
Microscopía de motas de fluorescencia
Una técnica que analiza estructuras macromoleculares, como las proteínas. El estudio de estas macromoléculas puede ayudar a los científicos a comprender cómo se mueven las proteínas y los ciclos de síntesis y degradación de proteínas.
Mineralogía: microscopio de fluorescencia
El estudio científico de las estructuras cristalinas, las propiedades físicas y la química de diferentes minerales. La fluorescencia se usa a menudo para identificar minerales, pero también se puede usar para identificar el lugar de origen del mineral.
La industria textil:
La microscopía de fluorescencia es especialmente beneficiosa en el análisis de fibras. Los microscopios de fluorescencia confocal son especialmente útiles en aplicaciones textiles, ya que ofrecen vistas tridimensionales claras de fibras e hilos. Por otro lado, los microscopios de epifluorescencia son excelentes para estudiar materiales como el papel.
El estudio de la porosidad en la cerámica, que permite a los científicos medir la densidad, la resistencia y la durabilidad de un objeto. Generalmente, cuanto menos porosidad tiene una pieza de cerámica, más fuerte es, y cuanto más débil, mayor porosidad.
Una de las partes más importantes de la microscopía de fluorescencia es asegurarse de que las muestras estudiadas sean fluorescentes. Algunas muestras tienen una fluorescencia intrínseca (autofluorescencia), lo que significa que no requieren ninguna ayuda externa para ser fluorescentes, pero muchas otras muestras deberán etiquetarse/marcarse/teñirse como mencionamos anteriormente. La aplicación del microscopio de fluorescencia determinará qué tinción deberá usarse, si corresponde.
Uno de los riesgos de la microscopía de fluorescencia es la posibilidad de fotoblanqueo, que ocurre cuando las moléculas fluorescentes de una muestra se dañan químicamente debido a los electrones excitados. Con el tiempo, esto hace que la muestra en cuestión pierda su fluorescencia. Dos formas de intentar prevenir o reducir los efectos del fotoblanqueo incluyen minimizar la cantidad de iluminación utilizada y usar fluoróforos más fuertes.
¿Cuánto cuesta un nuevo microscopio de fluorescencia?
El conocido microscopio de fluorescencia puede llegar a costar entre $2400 y $21 000 o más, según las especificaciones y las personalizaciones que necesite.
En conclusión, el campo de la microscopía de fluorescencia es amplio, pero todos los microscopios de fluorescencia tienen algunas cosas en común: tienen un espejo dicroico, filtros de excitación y emisión y, lo más importante, se basan en la fluorescencia y la fosforescencia para observar minuciosamente sus muestras. Ya sea que esté buscando un microscopio de fluorescencia o simplemente disfrute aprendiendo cosas nuevas, nos complace que haya visitado.
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